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引言

過氧化氫參與細胞內(nèi)生理活動，對細胞代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)和生理過程至關重要，在單細胞水平上定性識別、定量表征過氧化氫可更全面揭示異質(zhì)性細胞特征，促進疾病檢測和藥物篩選的發(fā)展。單細胞由于其結(jié)構(gòu)多樣性、快速代謝物動力學特征和難以預測的信號放大等因素影響，活體單細胞檢測仍非常具有挑戰(zhàn)性。SERS技術具備非侵入性、低自發(fā)熒光、高靈敏度等優(yōu)勢，已成為檢測分析細胞代謝產(chǎn)物的前景技術，可用于核酸、氨基酸、脂質(zhì)、葡萄糖、神經(jīng)遞質(zhì)等體系研究。然而，由于基底不可逆聚集和靶生物分子的非特異性吸附等因素影響，SERS技術仍有低重復性、低再現(xiàn)性等缺點。同時由于普通光學顯微鏡難以定位追蹤待測物，SERS技術在復雜生物體系應用仍受很大限制。在這方面，暗場顯微鏡采用特殊的照明方式，只允許樣品散射的信號進入物鏡內(nèi)，可克服常規(guī)光學顯微針對均一樣品中的微小結(jié)構(gòu)成像時，透射或反射襯度不足的問題，利用這個方法可以看見突破衍射極限的微粒子。暗場散射和SERS技術相結(jié)合，有望實現(xiàn)原位實時活細胞中代謝物檢測。

南京師范大學王琛教授課題組在Au納米粒子上覆蓋二維共價有機框架（COFs）構(gòu)建尺寸可控、富集力強、穩(wěn)定性高和生物相容性更好的核殼結(jié)構(gòu)(Au@COF)生物傳感器。并用拉曼光譜/暗場散射成像雙模技術實時監(jiān)測活細胞中過氧化氫代謝物水平。實驗結(jié)果證明，該生物納米傳感器簡單、高效，可實現(xiàn)過氧化氫和細胞代謝產(chǎn)物的在線檢測。本研究為開發(fā)基于COF的SERS生物傳感平臺提供了實驗思路，為細胞代謝產(chǎn)物相關疾病早期診斷提供一種有效方法。

結(jié)果分析

本文通過在Au納米粒子上覆蓋二維共價有機框架（COFs），COFs殼層結(jié)構(gòu)均勻包裹Au納米粒子，提高基底穩(wěn)定性；納米級多孔結(jié)構(gòu)有效富集生物分子，提高分子濃度和靈敏度；多孔COFs層可消除不均勻分子吸附，使基底具備高穩(wěn)定性和高抗干擾性，此外，COFs具有良好生物相容性。利用SERS/暗場散射雙模檢測技術，有效定位追蹤單個細胞靶向微區(qū)，實現(xiàn)原位監(jiān)測細胞中H₂O₂代謝產(chǎn)物。

圖1 Au@COF納米傳感器合成示意圖、拉曼光譜圖和暗場顯微圖像

圖2（A）Au@COF/MPBA納米傳感器感應機制。（B） MPBA、MPBA與H2O2和HBT的拉曼光譜。（C） Au@COF/MPBA被不同氧化后的拉曼光譜圖（D） Au@COF/MPBA被不同氧化后的I₁₀₇₅/I₁₀₂₃拉曼峰強度比，Au@COFn濃度為0.5 nM

圖3 （A） 不同H₂O₂濃度下， B-O-H變形振動的1023 cm^?1拉曼峰；（B）I₁₀₇₅/I₁₀₂₃拉曼峰強度比與H₂O₂濃度函數(shù)關系（C）I₁₀₇₅/I₁₀₂₃拉曼峰強度比率與時間變化關系，Au@COF為0.5nM

圖4（A） COF外殼保護作用示意圖，COF外殼阻擋大分子進入；（B）細胞培養(yǎng)基中不同H₂O₂濃度下Au@COF/MPBA的拉曼光譜圖；（C-D）細胞培養(yǎng)基和BSA溶液中，I₁₀₇₅/I₁₀₂₃拉曼峰強度比與H₂O₂濃度函數(shù)關系，Au@COF為0.5nM。

圖5 Au@COF/MPBA納米傳感器用于細胞內(nèi)成像；（A）共焦顯微鏡檢測光路示意圖；（B） MCF-7細胞在Au@COF/MPBA孵育后的明場、暗場圖像；(C-D)不同采樣點的拉曼光譜圖，1-3采樣點在1023和1075cm^-1有拉曼峰，Au@COF濃度為0.25nM。

圖6 細胞內(nèi)不同藥物處理后H₂O₂的成像圖；(A)未處理的細胞,(B)2 mg·mL^?1的NAC，（C）1 mM PMA和（D）200 mM H₂O₂；從左到右依次為明場（BF）圖像、暗場（DF）圖像、拉曼Mapping圖像和合成圖像。紅色圖為1075 cm^?1拉曼峰Mapping圖，紅色圖為1023 cm^?1拉曼峰Mapping圖。Au@COF濃度為0.5nM。

結(jié)論

在本文中，王琛教授課題組設計一款高穩(wěn)定性、尺寸可控、富集力強和生物相容性高的核殼結(jié)構(gòu)Au@COF納米生物傳感器。采用拉曼光譜/暗場散射成像雙模技術實時監(jiān)測活細胞中過氧化氫代謝物水平。盡管目前納米傳感器仍處于起步階段，Au@COF納米傳感器由于COF外殼吸附效應和Au核LSPR效應，可實現(xiàn)不同探針分子類型，為活細胞代謝物檢測提供一種前途策略。

南京師范大學王琛教授課題組簡介

王琛，南京師范大學化學與材料科學學院教授，博士生導師，國家優(yōu)秀青年科學基金獲得者（2020年），江蘇省“青藍工程"優(yōu)秀青年骨干教師、中青年學術帶頭人；南京師范大學本科、碩士，2011年博士畢業(yè)于南京大學化學化工學院生命分析國家重點實驗室，2012-2016南京大學從事物理學博士后，2016-2017年麻省理工學院（MIT，美國）訪問學者。至今，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學術期刊發(fā)表研究論文60 余篇；參編英文圖書 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多項國家自然科學基金、江蘇省重點研發(fā)、江蘇省自然科學基金等項目；擔任Chinese Chemical Letters期刊編委，中國分析測試協(xié)會青年學術委員會委員，江蘇省材料學會副秘書長。

文章信息

本文以“SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@COF nanosensor"為題發(fā)表在Sensors and Actuators: B. Chemical期刊上。南京師范大學王琛老師為通訊作者。

本研究暗場顯微圖像和拉曼光譜數(shù)據(jù)使用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，如需了解該產(chǎn)品，歡迎咨詢。

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